Цель занятия: изучить основные серотипы сальмонелл и обосновать необхо­димость их типизации, отработать методики, биохимической и серологической типизации сальмонелл.

План работы:

Определить род возбудителей пищевых токсикоинфекций путем изучения посевов на средах короткого пестрого ряда и на трехсахарном агаре.

Рассмотреть основные серотипы сальмонелл и обосновать необходимость их типизации.

Провести биохимическую типизацию возбудителей сальмонелл путем изу­чения посевов на средах длинного пестрого ряда.

Провести серологическую типизацию сальмонелл при помощи агглютини­рующих сальмонеллезных сывороток.

Рассмотреть ветеринарно-санитарную оценку возбудителей пищевых ток­сикоинфекций.

Материальное обеспечение: среды с посевами, сделанными студентами на предыдущем занятии, пробирки-10 шт., пипетки, предметные стекла, бактерио­логическая петля, бактериологический мостик, простоквашница, газовая горел­ка (спиртовка), наборы диагностических агглютинирующих сальмонеллезных сывороток комплексных и монорецепторных, таблицы («Рост возбудителей пищевых, токсикоинфекций на длинном пестром ряде», «Схема серологической типизации сальмонелл», «Состав первого набора диагностических сальмонел­лезных сывороток»), вода дистиллированная, раствор для дезинфекции рук, спирт этиловый.

Основные серотипы сальмонелл и их практическое значение В настоящее время известно более 2000 серотипов сальмонелл. Наиболее па­тогенными для человека и многих видов домашних животных является: S. typhi murium, для крупного рогатого скота S. Dublin, S. enteritidis; для свиней: S. cholerae suis, S. typhi suis; для птиц: S. gallinarum, S. pullorum. Все вышепере­численные серотипы сальмонелл являются для человека патогенными или условнопатогенными. Сальмонеллы обладают высокой устойчивостью к термиче­ской обработке и в течение длительного времени могут сохраняться в мясе и других продуктах. Кроме того, следует отметить, что бактерии рода Salmonella

обладают преимущественно сахаролитическими свойствами и практически не выделяют протеолитических ферментов, поэтому при органолептическом ис­следовании зараженных продуктов обычно не обнаруживают видимых измене-ний. Эти свойства сальмонелл способствуют широкой распространенности данной пищевой токсикоинфекции.

Значение типизации сальмонелл и других возбудителей пищевых токсикоинфекции

Типизация возбудителей пищевых токсикоинфекции необходима, для того чтобы установить патогенность данного возбудителя для человека и других видов животных; для выявления источника пищевой токсикоинфекции; для разработки оптимальных способов лечения пищевых токсикоинфекции и под­бора наиболее эффективных антибиотиков и лечебных сывороток; для профи­лактики сальмонеллезов и колибактериозов в хозяйствах и оптимального под­бора вакцин и сывороток.

Биохимическая типизация возбудителей пищевых токсикоинфекции

по средам длинного пестрого ряда

Биохимическая типизация основана на различии у сальмонелл определенных ферментов. В силу ферментных различий одни бактерии способны разлагать те или иные углеводы или спирты, а другие такой способностью не обладают. При биохимической типизации применяют среды длинного пестрого ряда. Для этого необходимо произвести учет роста возбудителей пищевых токсикоин­фекций на длинном пестром ряде. Если исследуемый возбудитель расщепляет какой-то конкретный сахар, то при его распаде выделяются различные кислоты, рН среды Гиса становится кислой и индикатор Андреде окрашивает среду в красный цвет. Если сахар не расщепляется, то среда остается желтой и реакция считается отрицательной. После учета реакции полученные результаты сравни­вают с биохимическими свойствами возбудителей пищевых токсикоинфекции (см. табл. 5) и методом исключения выявляют конкретный серотип бактерии.

Если по результатам проведенного исследования оказалось, что два или не­сколько серотипов сальмонелл обладают одинаковыми биохимическими свой­ствами, то для типизации возбудителя можно воспользоваться одним из сле­дующих способов: удлинить пестрый ряд (сделать пересев на среды Гиса с теми сахарами, которые по-разному расщепляются сравниваемыми серотипами сальмонелл); провести серологические реакции с монорецепторными сыворот­ками, реагирующими со сравниваемыми серотипами сальмонелл. Установле­нию серотипа сальмонелл может способствовать логический анализ (эпизоотическое состояние населенного пункта, география распространенности сравни­ваемых серотипов, их патогенность для данного вида животных).

Биохимическую типизацию бактерий родов Е. Соli и Proteus проводят анало­гичным образом (см. табл. 6).

Магниевая среда Раппапорт-Вассилиадис, 500 г/уп, Кат.№ 107700
- Salmonella enrichment broth RAPPAPORT - Магниевая среда Раппапорта, 500 г/уп, Кат.№ 110236
- Tetrathionate enrichment broth Muller-Kauffman - Тетратионатный бульон, 500 г/уп, Кат.№ 110863
- Muller - Kauffmann Tetrathionate - Novobiocin Broth (MKTTn ) - Тетратионатный бульон с новобиоцином, 500 г/уп, Кат.№ 105878
- Bismuth sulfite agar WILSON - BLAIR - Висмут-сульфитный агар, 500 г/уп, Кат.№ 105418
- Hektoen enteric agar - Гектоеновый агар, 500 г/уп, Кат.№ 111681
- SS - agar - Сальмонелла-шигелла агар, 500 г/уп, Кат.№ 107667
- BPLS (Brilliant - green Phenol - red Lactose Sucrose Agar ) - Лактозо-сахарозный агар с бриллиантовым зеленым и феноловым красным, 500 г/уп, Кат.№ 107232
- XLD -агар - Ксилозо-лизин-дезоксихолатный агар для выделения и дифференциации патогенных энтеробактерий, 500 г/уп, Кат.№ 105287
- XLT4 agar - Ксилозо-лизиновый c тергитолом 4 (полностью ингибирует роста протея), 500 г/уп, Кат.№ 113919
- XLT4 Supplement - Селективная добавка к среде XLT4 агар, 100 мл/уп, Кат.№ 108981
- Rambach agar - Хромогенный Рамбах агар на сальмонеллы на 250 опред., 4 флакона х 250 мл, Кат.№ 107500
- MSRV (Modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis) - Полужидкая среда для ускоренного выделения сальмонелл из продуктов и сырья, 500 г/уп, Кат.№ 109878
- MSRV Selective Supplement - Селективная добавка (новобиоцин, 10 мг) к среде MSRV, 10 флаконов/уп, Кат. № 109874
- Salmosyst broth base - Неселективное обогащение, 500 г/уп, Кат.№ 110153
- Salmosyst selective tablets - Селективное обогащение сальмонелл - тетратионатная среда в таблетках, 250 табл./уп, Кат.№ 110141
- KLIGLER agar - Агар Клиглера, 500 г/л, Кат.№ 103913
- Triple sugar iron agar - Трехсахарный агар с железом, 500 г/уп, Кат.№ 103915
- Lysine iron agar - Лизиновый агар с железом для дифференциации и идентификации энтеробактерий; определение лизиндекарбоксилазы и сероводорода, 500 г/уп, Кат.№ 111640
- SIMMONS citrate agar - Цитратный агар Симмонса для идентификации, 500 г/л, Кат.№ 102501
- Singlepath Salmonella - Экспресс-тест (20 мин) на сальмонеллы, 25 тестов/уп, Кат.№ 104140

Сальмонеллы (Salmonella spp .)
Род сальмонелла относится к семейству Enterobacteriaceae. Бактерии палочковидные, грамотрицательные, аспорогенные, преимущественно подвижные. Во всем мире сальмонелла является одним из наиболее распространенных возбудителей пищевых отравлений, инфицирующих большинство видов сырых продуктов (например, мясо, яйца, растительные продукты). Устойчивость бактерий к высушиванию в сочетании с их высокой термостойкостью создает проблему защиты от патогена большинства сухих и полусухих продуктов. Согласно законодательству в сфере питания большинства стран содержание сальмонеллы не допускается в 25 г пищевого продукта. Для получения простого ответа (да/ нет) о наличии сальмонеллы в пище и кормах при использовании традиционных микробиологических методов необходимо в общей сложности затратить до 5 дней. Для продуктов, нуждающихся в быстрой реализации, это означает значительную задержку. Для удовлетворения требований производителей продуктов питания относительно быстрой реализации готовой продукции и снижения затрат на ее хранение необходимо использовать инновационные ускоренные методы обнаружения сальмонеллы. Таким образом, ускоренные методы анализа сальмонелл вызывают все больший интерес. Экспресс-тесты, предлагаемые для этих целей, должен быть специфичны, чувствительны, удобны и экономически эффективны. В зависимости от количества исследуемых образцов и требований к специфичности метода выбор может быть сделан либо в пользу молекулярного анализа бактериальной ДНК методом ПЦР (как правило, для высокопроизводительной лаборатории), либо в пользу иммунодиагностических тестов (при анализе меньшего количества образцов).

Сальмонеллез
У большинства людей, инфицированных сальмонеллой, развиваться диарея, лихорадка и боли в животе через 12-72 ч после заражения. Болезнь обычно длится 4-7 дней, и большинство пациентов выздоравливают без лечения. Тем не менее, в некоторых случаях заболевание может быть настолько серьезными, что требуется госпитализация. У таких больных сальмонеллезная инфекция может распространиться из кишечника в кровь и другие участки тела. Если больной своевременно не прошел лечение антибиотиками, то это может привести к смерти. Пожилые люди, младенцы и лица с нарушениями иммунной системы будут в первую очередь поражаться наиболее тяжелой формой заболевания.

Патогенность
Сальмонеллы относятся к наиболее опасным возбудителям кишечных инфекций человека и сельскохозяйственных животных. Согласно ВОЗ в мире каждый год регистрируется до 1,3 млрд. случаев сальмонеллеза, при этом динамика заболевания населения имеет тенденцию к росту. При отсутствии эффективного лечения летальные случаи у людей составляют от 1-3 до 10-15%. Ежегодно в США заболевание регистрируется у 1,4 млн. жителей, а материальные затраты, связанные с последствиями и профилактикой болезни, оценивается в $1-2,3 млрд. В России эта болезнь в структуре острых кишечных инфекций занимает второе место.

Таксономия
Род Salmonella , насчитывающий свыше 2500 сероваров (серотипов), входит в семейство Enterobacteriaceae (энтеробактерий). По современной классификации, основанной на ДНК-анализе, род Salmonella включает патогенный для человека и теплокровных животных вид S. enterica. Этот вид разделен на 6 подвидов. Подвид S. enterica subsp. Enteritidis - возбудитель пищевых токсикоинфекций. Подвиды S. enterica subsp. Typhi, S. enterica subsp. Paratyphi A, B - возбудители у людей брюшного тифа, паратифов А и В.

Морфология
Клетки сальмонеллы - это подвижные (благодаря жгутикам), аспорогенные грамотрицательные прямые палочки (0,5-1х1-3 мкм) с закругленными концами. Встречаются также неподвижные особи и штаммы. Капсулу не образуют, факультативно-анаэробные хемоорганотрофы с окислительным и бродильным метаболизмом. Хорошо растут на простых питательных и желчесодержащих средах. На плотных средах могут образовывать колонии в R-форме (шероховатые) и S-форме (гладкие), на жидких дают диффузное помутнение. Колонии в S-форме средних размеров, блестящие, полупрозрачные, с голубоватым оттенком. При посеве крови лучшими жидкими средами обогащения является желчный бульон, при посеве биоматериалов (фекалии, желчь, моча), содержащих дополнительную флору, селенитовый бульон. На лактозосодержащих дифференциальных средах бактерии образуют бесцветные колонии, на висмут-сульфитном агаре - колонии черного цвета.

Биохимическая характеристика
Сальмонеллы обладают выраженной, характерной для рода биохимической активностью. Для их идентификации важно учитывать следующие биохимические свойства:
1) ферментация глюкозы и других углеводов (маннита, мальтозы) до кислоты и газа (подвид S.t yphi выделяет только кислоту),
2) отсутствие ферментации лактозы, сахарозы, салицина и мочевины,
3) реагируют с метилротом, продуцируют сероводород, индол (как правило) не образуют, - оксидаза отрицательны, каталаза положительны, реакция Фогеса-Проскауэра отрицательна,
4) температурный оптимум для роста - 35-37 о С, рост полностью прекращается при 5 о С; оптимум рН=7,2-7,4.

Согласно серологической классификации подавляющее большинство патогенных для человека сероваров (серотипов) сальмонелл относится к A, B, C, D и E группам. Сальмонеллы типируют по схеме Кауффмана-Уайта в реакции агглютинации. Для ее постановки применяют гипериммунные сыворотки или моноклональные антитела к сальмонеллам. На серотипировании основаны диагностика сальмонеллеза и эпидемиологический анализ возбудителей.

Источники и факторы передачи инфекции
Сальмонеллезы (брюшной тиф, паратифы, гастроэнтериты, септицемия и др.) - широко распространенные пищевые заболевания животных и человека с фекально-оральным механизмом передачи инфекции. У человека пищевые токсикоинфекции сопровождаются поражением желудочно-кишечного тракта и обезвоживанием организма. Заражающая доза от 1000 до 10 тыс. клеток. Постоянная среда обитания - кишечник человека и теплокровных животных, являющихся резервуаром инфекции. Загрязненные пищевые продукты и сырье, а также вода - основные источники и факторы передачи возбудителя. В пищевые продукты патоген переходит из загрязненного сырья. Почва участвует в контактном пути передачи инфекции. Наличие сальмонелл в почве или воде всегда свидетельствует о загрязнении этих сред испражнениями инфицированных людей и/или животных - птиц, крупного рогатого скота, свиней, кошек, собак, голубей. Их инфицированность сальмонеллами колеблется от 6-7 до 80%.

Основные источники инфекции
В США на долю сальмонеллеза приходится около 9% пищевых инфекций, причем значительная часть населения этой страны является его бессимптомными бактерионосителями. Загрязненные птицепродукты, мясо и мясные продукты, молоко, сыр, сливочное масло, овощи и фрукты, полуфабрикаты и приправы (майонез, яичный порошок, кремы и др.) - основные источники сальмонеллеза. Пищевые продукты контаминируются бактериями также в процессе кулинарной обработки, контакта с носителями, производственным оборудованием, животными-переносчиками (мухи, мышевидные грызуны, комнатные животные). Продолжительность жизнеспособности сальмонелл зависит от вида продукции и условий среды обитания. Так, на поверхности овощей и фруктов бактерии выживают в течение 5-10 дней, в молоке - до 20 дней, в пиве и кефире - до 2 месяцев, в колбасных изделиях, мясе (включая соленое), сливочном масле - от 2 до 6 месяцев, в сырах - до 1 года, в замороженном мясе - до 2-3 лет.

Патогенез
Различную природу заболевания объясняют множественностью факторов патогенности (эндо-, экзотоксины и др.), которые еще недостаточно изучены. Все вирулентные сальмонеллы продуцируют эндотоксин, индуцирующий развитие лихорадки у инфицированных людей (с повышением температуры до 39-40 о). После перорального заражения, попав в тонкий кишечник, сальмонеллы инвазируют слизистую кишечника и, размножаясь в макрофагах, формируют первичный очаг инфекции. По окончании инкубационного периода (через 10-14 суток после заражения) попав в кровь, сальмонеллы вызывают бактериемию. Возбудители тифа и паратифа с током крови разносятся по всему организму, оседая в клетках печени, селезенки, легких, костного мозга, а также желчного пузыря. К концу 2-й недели от начала заболевания возбудитель выделяется из организма больного с мочой, испражнениями, материнским молоком, слюной. Иммунитет к заболеванию не формируется.

Методы обнаружения
Важную роль играет специфическая профилактика сальмонеллезов, заключающаяся в проведении ветеринарно-санитарных, санитарно-гигиенических и противоэпидемических мероприятий. Профилактика сопровождаются перманентным контролем возбудителя в пище, фураже, сырье и воде.

Классический метод

Среды для выделения сальмонелл
- Забуференная пептонная вода
- Среда Раппапорта-Вассилиадиса
- Селенитовая среда
- Тетратионатный бульон
- Ксилозо-лизин-дезоксихолатный агар
- Бриллиантовый зеленый агар
- Висмут-сульфит агар

Классическая методика исследования сальмонелл с использованием питательных сред. Однако из-за длительности процедуры анализа для определения патогена одного классического метода недостаточно.

Иммунохроматографи-ческие экспресс- тесты
Для ускорения выявления сальмонелл, значительного сокращения трудозатрат и экономии ресурсов в последние десятилетия за рубежом разработаны, испытаны и широко применяются ускоренные методы выявления возбудителя. Ускоренные методы позволяют существенно (на 24-48 ч) сократить продолжительность исследований. Обладая высокой чувствительностью, они обеспечивают надежное выявление сальмонелл в анализируемом материале.

Нормативная документация
- МР 24 ФЦ 976 Методы выявления патогенных микроорганизмов с использованием иммунохроматографических экспресс-тестов производства Merck (Германия)
- ГОСТ Р 50455-92. Мясо и мясные продукты. Обнаружение сальмонелл (арбитражный метод)
- ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002). Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella.
- ГОСТ Р 53665-2009. Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Метод выявления сальмонелл;
- СП 3.1.7.2616-10. Санитарно-эпидемические правила. Профилактика сальмонеллеза. М.: Роспотребнадзор. 2010.18 с.

Род Salmonella разделен на 4 вида (подрода). Вид I- S. kauffmani - объединяет большую часть патогенных для человека сальмонелл. Вид II - S. salamal - отличается от сальмонелл других видов способностью разжижать желатин и расщеплять малонат натрия. Вид III - S. arizona-объединяет сальмонеллы, ферментирующие (большей частью замедленно) лактозу и не сбраживающие дульцита. Вид IV-S. houtenae - включает «атипичные» в биохимическом отношении сальмонеллы, ферментирующие салицин и растущие в присутствии цианида калия.

Морфология . Бактерии рода Salmonella представляют собой мелкие палочки с закругленными концами, изредка овальной формы, длиной 2-4 мкм и шириной 0,5 мкм. Иногда они образуют нити. Бактерии подвижны, за исключением S. gallinarum - pullorum. Спор и капсул не образуют, грамотрицательны (рис. 15).

Культуральные свойства . Сальмонеллы относятся к аэробам, но отдельные виды могут развиваться при ограниченном доступе кислорода воздуха. Хорошо растут на простых питательных средах, за исключением некоторых ееротипов (S. paratyphi A., S. abortus ovis, S. pullorum, S. sendai, S. typhisuis), которые дают очень скудный рост. Резких различий в характере роста сальмонелл различных видов на простом МПА и простых жидких средах не наблюдается. Оптимальная реакция среды для роста сальмонелл слабощелочная (рН 7,2- 7,6); оптимальная температура 37°С, но могут развиваться в пределах от 6°С до 46°С. При рН 5-8 и температуре 20°С (или 38- 39°С) бактерии могут размножаться, но значительно медленнее, чем при оптимальных режимах роста.

На поверхности МПА в чашках Петри сальмонеллы образуют гладкие, круглые, очерченные, полупрозрачные, выпуклые, влажные колонии с металлическим блеском, иногда со слегка вдавленным центром (S-форма). Многие серологические типы бактерий рода Salmonella формируют на МПА вокруг колоний четко различимый слизистый вал - феномен валообразования. Феномен валообразования закономерно отсутствует у S. typhimurium, S. abortus ovis, S. pullorum, S. gallinarum. Наряду с S-формами колоний сальмонеллы формируют R-формы. Колонии R-формы в отличие от колоний S-формы шероховатые, мутные и сухие. На скошенном МПА колонии S-формы сальмонелл дают пышный рост с сильным помутнением конденсационной воды, а при росте на МПБ - с сильным помутнением среды (при кислой реакции среды на поверхности бульона иногда образуется пленка). R-формы колоний сальмонелл при росте на МПБ дают осадок, а надосадочная жидкость при этом остается прозрачной.

Общность морфологии и ряда культуральных свойств бактерий рода Salmonella не позволяет типизировать их по указанным признакам. Для этого кроме морфологии и культуральных свойств изучают ферментативные свойства и антигенную структуру, в отдельных случаях ставят биологическую пробу на лабораторных животных.

Ферментативные свойства . Ферментативные свойства бактерий обусловлены набором ферментов, отражают определенные условия питания и обмена веществ, свойственные данному виду микроорганизмов в тех или иных условиях внешней среды. Бактерии рода Salmonella характеризуются следующими ферментативными свойствами: не разжижают желатина, не разлагают адонита и не ферментируют сахарозу; подавляющее большинство не расщепляет салицина и не разлагает лактозу, не образует индола, не расщепляет мочевину, не дает реакции Фогес-Проскауера (реакция на ацетилметилкарбинол); ферментирует (за небольшим исключением мальтозу, маннит, сорбит, расщепляет глюкозу с образованием газа (S. typhi, S. pullorum обычно не образуют газа); дает положительную реакцию с метиловым красным, утилизирует аммоний и редуцирует нитраты; большинство из них продуцирует сероводород. Ферментативные и патогенные свойства некоторых бактерий рода Salmonella приведены в табл. 4.

Для изучения ферментативных свойств бактерий рода Salmonella обычно используют короткий цветной (пестрый) ряд, состоящий из сред с глюкозой, маннитом, ара-бинозой, дульцитом, рамнозой (среда Биттера); глицеринофуксиновый бульон (бульон Штерна). Помимо указанных сред для дифференциации серологических типов сальмонелл используют также среды с мальтозой, инозитом, трегалозой, ксилозой; лакмусовое молоко (изменение лакмусового молока при росте сальмонелл позволяет их дифференцировать по способности образовывать кислоту или щелочь). Вместо лакмусового можно использовать обезжиренное молоко с индикатором бромтимоловым синим (1 мл 0,4%-ного раствора в 100 мл молока). Известное значение для дифференциации сальмонелл имеет образование сероводорода культурой. Протеоли-тические свойства исследуют путем посева изучаемой культуры сальмонелл на МПЖ и молоко.

Ввиду сходства бактерий рода Salmonella с другими микроорганизмами семейства Enterobacteriaceae возникает необходимость их дифференциации. В настоящее время в бактериологической практике широко используют плотные дифференциально-диагностические питательные среды с лактозой (среды Плоскирева, Эндо, Левина). По способности бактерий ферментировать лактозу гальмонеллы отличают от часто сопутствующей Е. соН, поэтому при исследовании материала на сальмонеллы вначале производят высев на одну из дифференциально-диагностических сред. На этих средах Е. coli, ферментирующая лактозу с образованием кислоты и изменением цвета индикатора, образует колонии, отличающиеся по цвету от колоний сальмонелл, не ферментирующих лактозу. На среде Эндо бактерии Е. coli дают колонии красного цвета, часто с металлическим блеском, сальмонеллы - бесцветные или бледно-розовые (окрашенные в цвет среды); на среде Плоскирева Е. coli - колонии оранжево-красного цвета, сальмонеллы - прозрачные или нежно-розовые; на среде Левина Е.- coli формируют колонии черного цвета, окруженные ободком, сальмонеллы- прозрачные, нежно-розовые или розовато-фиолетовые. Для дифференциации сальмонелл и культураль-но сходных штаммов, а также бактерий рода Proteus и бактерий группы кишечных палочек применяют среды с мочевиной (среда Прейса, Ресселя, Олькеницкого), SS-агар (Salmonella - Shigella - агар) и др. Цвет этих сред обусловлен неодинаковой интенсивностью расщепления микроорганизмами азотистых веществ с образованием щелочных продуктов. Бактерии группы кишечных палочек и Proteus (за исключением 0-формы), как правило, на SS-arape не дают роста, а сальмонеллы растут в виде нежных, бесцветных колоний.

Плотные дифференциально-диагностические среды служат лишь для определения принадлежности бактерий к роду Salmonella и отделения их от сопутствующей мик­рофлоры.

Для наиболее эффективного выделения сальмонелл из патологического материала, содержащего большое количество сопутствующей микрофлоры, препятствующей их росту, используют специальные среды обогащения (Мюллера, Кауфмана и др.). Тетратионовый натрий, добавляемый в среду Мюллера, подавляет рост бактерий группы кишечных палочек, но не препятствует развитию сальмонелл. Среда Кауфмана представляет собой модифицированную среду Мюллера, к которой добавлены раствор бриллиантовой зелени и натуральная бычья желчь. Эти компоненты задерживают рост бактерий группы кишечных палочек и особенно протеуса, но способствуют росту сальмонелл.

Ферментативные свойства сальмонелл не всегда стабильны и могут изменяться в зависимости от условий внешней среды, поэтому правильное типизирование сальмонелл возможно лишь в результате изучения комплекса морфологических, культуральных, ферментативных свойств и антигенной структуры.

Антигенная структура . Она детально изучена Кауфманом, Уайтом, положена в основу современной серологической классификации бактерий рода Salmonella.

У бактерий рода Salmonella различают два основных антигенных комплекса: О- и Н-антигены. Это структурные элементы бактериальной клетки. Соматические О-антигены термоустойчивы и представляют собой липо-полисахариднополипептидные комплексы. Жгутиковые Н-антигены термолабильны, имеют белковую природу. Кроме того, у бактерий рода Salmonella обнаружен ряд других антигенов - поверхностных и капсульных. Между капсульными и поверхностными антигенами не существует резкого разграничения, переход осуществляется постепенно, поэтому оба антигена, и капсульный, и поверхностный, объединяются под общим названием К-антиген.

Название К происходит от немецкого слова «kapsel». В группе Salmonella доказано наличие трех К-антигенов: антиген 5, V i -антиген и М-антиген.

Схема серологической классификации сальмонелл разработана Кауфманом и Уайтом. Согласно предложенной схеме бактерии из рода Salmonella были разбиты на пять больших групп по общности соматического 0-антигена: А, В, С, D, Е. Оказалось, что О-антигены неоднородны и состоят из двух и более рецепторов (фракций), которые были обозначены в схеме римскими цифрами (I, II, III и т. д.). В свою очередь H-антигены, специфические и неспецифические оказались также неоднородными. Рецепторы специфических H-антигенов были обозначены малыми буквами латинского алфавита, а рецепторы неспецифических H-антигенов - арабскими цифрами и частично буквами.

Дальнейшее изучение антигенной структуры бактерий из рода Salmonella, выделенных от людей и животных, обнаруживало все большую сложность этой структуры, сопровождаясь все время открытием новых О- и H-антигенов, а следовательно, и новых типов. В серологические схемы Кауфмана - Уайта в 1939 г. на II Международном конгрессе микробиологов было введено разделение H-антигена на фазы I и II с упразднением деления на пецифическую и неспецифическую фазы. В обозначении 0-антигенов сальмонелл римские цифры были заменены арабскими.

В настоящее время для обозначения серологических групп в схеме исчерпаны все буквы латинского алфавита и последующие группы (51 и дальше) обозначены цифрами их соматических антигенов. Число систематизирован-ных сальмонелл превысило в настоящее время 1600.

Для полного типизирования сальмонелл по антигенной структуре достаточно иметь ограниченный набор монорецепторных О- и H-сыворрток, позволяющих идентифицировать типы сальмонелл групп А, В, С, D, E, которые чаще всего выделяются от людей и животных.

Помимо вышеописанных методов типизирования сальмонелл в последнее десятилетие нашел применение метод фаготипизирования.

В связи с тем что микроорганизмы из рода Salmonella, вызывающие пищевые токсикоинфекции , широко распространены в объектах внешней среды, особенно в пищевых продуктах, важное значение имеют сведения о влиянии на их жизнедеятельность различных физических факторов и химических веществ.

Устойчивость . Некоторые виды сальмонелл сохраняют свою жизнеспособность в течение 3 мес в комнатной пыли и навозе.

Сальмонеллы устойчивы к высушиванию. Так, они сохраняют. жизнеспособность в сухом кале телят до 185 дней (срок наблюдения), в сухом кале взрослого крупного рогатого скота - до 4 лет, в мышином кале - до 1 года (И. В. Шур, 1970). В различных почвах сальмонеллы остаются жизнеспособными от нескольких недель до 97 мес. Сальмонеллы в воде открытых водоемов сохраняли жизнеспособность от 15 до 45 дней в зависимости от температуры и других факторов. S. dublin выживала в предварительно прокипяченной воде: при 0°- 34-104 дня, при 15°С -5-87 дней, при 37°С - 3-20 дней. S. typhimurium в стерильной водопроводной воде оставалась жизнеспособной 250-270 дней, a S. enteritidis -230-250 дней (Ю. Б. Сафаров и М. А. Курбанова, 1966). Имеющиеся данные о влиянии высоких температур на жизнедеятельность бактерий рода Salmonella весьма противоречивы. Это объясняется тем, что отдельные виды сальмонелл и даже отдельные штаммы одного вида обладают различной устойчивостью. Так, S. typhimurium в физиологическом растворе при 70°С погибают через 5 мин, а в МПБ -через 10 мин; S. chole-гае suis как в физиологическом растворе, так и в МПБ при 70°С погибают через 5 мин (В. А. Килессо, Е. И. Выдрина, 1959). Сальмонеллы устойчивы к низким температурам. Так, на плотных питательных средах (МПА) культуры S. cholerae suis при 0°С остаются жизнеспособными в течение 142 дней, а при - 10°С - в течение 115 дней.

Сальмонеллы устойчивы к высоким концентрациям поваренной соли, особенно в средах, содержащих белок. В мясном рассоле, содержащем 29% поваренной соли, при 6-12°С S. paratyphi В сохраняли жизнеспособность до 4 мес; a S. enteritidis - 8 мес, S. typhimurium и S. anaturn выживали в мясном бульоне с концентрацией поваренной соли 10% при 3-5°С в течение 70 дней, а в МПБ, содержащем 20% поваренной соли и больше, - в течение 42-45 дней. Они устойчивы также к действию некоторых кислот. Например, после обработки при комнатной температуре бульонных культур S. dublin и S. cholerae suis 1%-ным раствором молочной кислоты они погибали через 9-12 ч. В результате обработки при комнатной температуре бульонных культур S. cholerae suis 6-8%-ным раствором уксусной кислоты их гибель наступала через 18-24 ч.

Сальмонеллы, находящиеся в пищевых продуктах (особенно в мясных), очень устойчивы к тепловой обработке. Мясо, обсемененное S. enteritidis и S. cholerae suis, полностью обезвреживается только при проварке его кусками массой 500 г и толщиной 6 см в течение 3 ч при 100°С. И. С. Загаевский (1961) установил, что S. typhimurium погибает в толще куска свинины через 10 мин после того, как температура внутри куска достигнет 80°С.

По действующим правилам ветеринарно-санитарнои экспертизы (1970) мясо, полученное от животных, больных сальмонеллезом, считается обезвреженным после проваривания его кусками массой не более 2 кг, толщиной 8 см в открытых котлах в течение 3 ч, а в автоклаве при 0,05 МПа в течение 2,5 ч (температура внутри куска не ниже 80°С). В мясе, хранящемся в холодильнике при низкой плюсовой температуре, сальмонеллы не только выживают, но и способны размножаться.

Соление и копчение мяса оказывают слабое воздействие на сальмонелл. В соленом и копченом мясе некоторые сальмонеллы сохраняют жизнеспособность в середине кусков до 75-97 дней.

При размножении сальмонелл в молоке его внешний вид и вкус не изменяются. Пастеризация молока при 85°С в течение 30 мин в производственных условиях способствует полному уничтожению сальмонелл. В высушенном твороге, искусственно зараженном S. typhimurium и S. dublin и хранившемся при О-4°С, сальмонеллы выживают в течение 56 мес, а при комнатной температуре-34 мес. Сальмонеллы, которые были введены в сливочное масло, хранившееся при комнатной температуре, оставались жизнеспособными до 128 дней, а при О-4°С -284 дней. S. dublin и S. cholerae suis, внесенные в простоквашу кислотностью 85°Т, оставались жизнеспособными в течение 48 ч (предельный срок хранения простокваши) при 0-4°С.

В замороженных яичных желтках S. tenessee, S. mon-tevideo, S. typhimurium сохраняли жизнеспособность после 13-месячного хранения при -20°С. В яичном меланже S. cholerae suis погибали при 65°С лишь через 20 мин.

Патогенность . Вопрос о разграничении бактерий рода Salmonella на монопатогенные для человека и для животных и бипатогенные до настоящего времени еще изучен недостаточно.

В процессе эволюции сальмонеллы приспособились к существованию в организме того или иного хозяина. Однако эта избирательная способность не определяет абсолютной монопатогенности данного возбудителя в отношении естественного хозяина.

Резкое деление бактерий рода Salmonella на патогенных только для человека или только для животных следует считать необоснованным. Так, S. cholerae suis, которую раньше считали патогенной только для свиней, может вызывать заболевание как различных животных, так и человека. В этиологии сальмонеллезов у людей значительную роль играет S. pullorum, которую долгое время не считали патогенной для человека. S. paratyphi В до недавнего времени считали патогенной только для человека.

В настоящее время установлено, что люди могут быть бактерионосителями и бактериовыделителями различных серологических типов сальмонелл вследствие перенесенного заболевания или употребления в пищу зараженных сальмонеллами продуктов. Кроме того, сальмонелло-носительство у человека возможно в результате контакта с больными людьми и животными, а также с обсемененными продуктами.

Довольно значительная часть бактерионосителей и бактериовыделителей встречается среди работников пищевых предприятий, причем типы выделяемых сальмонелл весьма разнообразны. Но преобладают сальмонеллы серологической группы В - S. typhimurium.

Эпидемиологическая опасность сальмонелловыделе-ния у людей связана с распространением инфекции среди населения через инфицированные пищевые продукты и возникновением вторичных форм сальмонеллезов, наслаивающихся на первичные патологические процессы (истощение, авитаминозы и пр.).

У животных существует три основные формы сальмонеллеза : первичные сальмонеллезы; вторичные сальмонеллезы; бактерионосительство.

Первичные сальмонеллезы - заболевания, вызываемые специфическими возбудителями из рода Salmonella (сальмонеллез телят, сальмонеллез поросят, инфекционный аборт лошадей и пр.). Они характеризуются специфической клинической картиной и патологоанатомическими изменениями, свойственными животным данного вида.

Вторичные сальмонеллезы не представляют собой самостоятельных заболеваний, а являются результатом патогенного действия микробов, обитающих в здоровом организме. Чаще всего заболеванию вторичными сальмонеллезами подвержены истощенные животные, животные с желудочно-кишечными заболеваниями, с обширными травмами и т. п. Эти заболевания не имеют специфической клинической картины.

Животные с вторичными сальмонеллезами представляют большую опасность для человека. Наиболее часто возбудителями их являются сальмонеллы группы В, С, D, Е. Поставить диагноз вторичного сальмонеллеза сложно, так как признаки заболевания маскируются симптомами основной болезни.

Бактерионосительство возникает у животных и человека в результате перенесения заболевания. При этом возбудитель, находясь в организме, длительное время выделяется во внешнюю среду с калом, мочой, слюной.

Многие серологические типы сальмонелл выделены у животных различных видов. У крупного рогатого скота преобладает S. typhimuriurn, встречаются S. dublin, S. paratyphi В, S. enteritidis, а также многие редкие типы сальмонелл: S. abortus bovis, S. brandenburg, S. monte-video, S. derby и др. У овец обнаружены S. dublin, S, anaturn и S. abortus ovis. В результате исследований, выполненных за рубежом, от крупного рогатого скота выделено свыше 30 различных типов сальмонелл.

Сальмонеллоносительство довольно широко распространено среди свиней. В настоящее время вопреки обычному представлению о преобладании у свиней S. cholerae suis выделены разнообразные серологические типы сальмонелл (наиболее часто выделяют S. typhimurium).

У лошадей обнаружены S. typhimurium и S. dublin. По степени сальмонеллоносительства лошади стоят на четвертом месте после телят, взрослого рогатого скота и свиней.

Помимо указанных животных сальмонеллоносительство, характеризующееся большим разнообразием серологических типов сальмонелл, выявлено у грызунов (особенно у мышей и крыс), кошек, собак, диких зверей и рыб.

В эпидемиологии сальмонеллезов большую роль играют водоплавающие птицы, а также куры, индейки, являющиеся носителями различных типов сальмонелл, в том числе и наиболее патогенных для человека S. typhimurium. Сальмонелл обнаруживают не только в органах и мышцах птиц, но и в яйцах. Яйцо, обсемененное сальмонеллами, обычно не имеет каких-либо органолептических изменений.

Продукты животного происхождения играют большую роль в эпидемиологии и эпизоотологии сальмонеллезов. Как показали многочисленные наблюдения, человек заражается сальмонеллами в результате употребления мяса и мясных продуктов. Для животных наибольшую опасность представляют сальмонеллоносители и корма животного происхождения, инфицированные сальмонеллами.

Мясо животных-сальмонеллоносителей и приготовленные из него продукты также опасны для человека. Кроме того, возможны случаи обсеменения мяса при убое и разделке туш животных. Даже при контакте с сырым мясом люди могут заражаться и оставаться сальмонеллоносителями. Доказано, что главная роль в возникновении сальмонеллезов у людей принадлежит мясу крупного рогатого скота.

‘Причиной массовых вспышек сальмонеллеза может быть и конина. Баранина редко является источником заражения. Следует отметить, что убой животных, находящихся в личном пользовании, а также мясо вынужденно убитых животных играют немаловажную роль в возникновении сальмонеллезов.

В эпидемиологии сальмонеллезов большое значение имеет кулинарная обработка мяса. Так, наибольшую опасность представляет, например, мясной фарш, скоропортящиеся колбасы (ливерная, кровяная), студни и пр.

В большинстве случаев мясо обсеменяется через людей - сальмонелловыделителей, реконвалесцентов - либо через насекомых, а также мышей и крыс. Сальмонеллы, попавшие на тушу даже в небольшом количестве, при соответствующей температуре и влажности могут быстро размножаться и проникать вглубь мышц.

Молоко и молочные продукты гораздо реже, чем мясные, являются причиной пищевых отравлений. Обсеменение молока сальмонеллами может быть эндогенным и экзогенным. Инфицирование молока главным образом происходит через загрязненную посуду, доильные аппараты, руки доильщиц и т. п. Часто фактором передачи сальмонелл служит инфицированное молоко от больных коров, а также молочные продукты, инфицированные после их приготовления.

Диагностика . При пищевых токсикоинфекциях, вызванных бактериями из рода Salmonella , исследуют рвотные массы, промывные воды желудка, испражнения, мочу и пищевые продукты. Поступивший в лабораторию материал подвергают микробиологическому анализу, который предусматривает посев на плотные дифференциальные питательные среды и среды накопления. Выделенную культуру испытывают на патогенность на белых мышах. Одновременно с выделенной чистой культурой исследуемый материал и подозреваемые пищевые продукты используют для биологической пробы.

Профилактика . Профилактика пищевых отравлений должна включать мероприятия, направленные на ликвидацию сальмонеллезной инфекции, а также условий ее возникновения и распространения. Эти мероприятия должны проводить как органы здравоохранения, так и ветеринарная служба.

Род Salmonella объединяет более 2000 представителей, широко распространенных в природе. Они вызывают заболевания у человека и животных. К роду сальмонелл относятся возбудители брюшного тифа, паратифов А и В и пищевых токсикоинфекций.

Возбудитель брюшного тифа (S. typhi) был впервые обнаружен в 1880 г. Эбертом в органах людей, умерших от брюшного тифа. В 1884 г. Гаффки выделил чистую культуру микроба. Позднее, в 1896 г., Ашар и Бансод нашли в гное и моче больных, у которых наблюдалась клиническая картина брюшного тифа, палочки, по биохимическим и серологическим свойствам отличающиеся от возбудителя брюшного тифа. Они были названы паратифозными— S. paratyphi А и S. paratyphi В. Из возбудителей пищевых отравлений первым был открыт в 1885 г. Сальмоном возбудитель холеры свиней — S. cholerae suis. В 1888 г. Гертнер при вспышке пищевых токсикоинфекций после употребления в пищу мяса больной коровы выделил S. enteritidis. В дальнейшем были описаны сальмонеллы мышиного тифа — S. typhimurium и другие микробы, которые по ряду признаков были сходны между собой, и объединены в род Salmonella, названный в честь Сальмона.

Морфология и биологические свойства. Сальмонеллы представляют собой короткие палочки с закругленными концами, размером в среднем 1—3 мкм. Все они подвижны благодаря наличию перитрихиально расположенных жгутиков. Спор и капсул не образуют. Хорошо окрашиваются анилиновыми красками, грамотрицательны. Факультативные аэробы. Хорошо растут на простых питательных средах при температуре 20—40°С и рН от 5,0 до 8,0 при оптимуме 37°С и рН 7,2—7,4. Па жидких средах дают равномерное помутнение. На мясо-пептонном агаре колонии более мелкие, чем у кишечных палочек, нежные, полупрозрачные. На дифференциально-диагностических средах Эндо, Левина, Плоскирева колонии мелкие, бесцветные. На висмут-сульфит-агаре колонии черного цвета.

Ферментативные свойства сальмонелл (см. табл. 3) довольно постоянны: не разлагают лактозу и сахарозу, ферментируют глюкозу и маннит с образованием кислоты и газа, хотя встречаются типы, ферментирующие их только до кислоты (например, сальмонелла тифа). Большинство сальмонелл расщепляет белки с образованием сероводорода, не образует индола, не разжижает желатина. Сальмонеллы содержат эндотоксин липополисахаридно-протеиновой природы. Он термоустойчив, обладает антигенными свойствами.

Устойчивость. Сальмонеллы устойчивы во внешней среде. В пыли, во льду, в чистой воде сохраняются до З мес. При температуре 70°С гибнут в течение 5—10 мин, при 10°С — мгновенно. В соленом и копченом мясе саль-монеллы сохраняют жизнеспособность 27,2 мес. В молоке могут размножаться. Под действием 1 % раствора сулемы, 3—5% раствора карболовой кислоты и хлорамина погибают в течение нескольких минут.

Антигенная структура и классификация. Сальмонеллы содержат два основных антигенных комплекса: О-соматический и Н-жгутиковый. О-антиген — липополисахаридно-протеиновый комплекс, термостабилен, инактивируется под действием формалина, соответствует эндотоксину бактериальной клетки. Н-антиген белковой природы, термолабилен, легко разрушается спиртом и фенолом. Устойчив к действию формалина. На этом свойстве основано получение Н-диагиостикумов. О- и Н-антигены у различных представителей сальмонелл неоднородны, что было положено в основу классйфйкации этих бактерий, разработанной Кауфманом й Уайтом (табл. 4).

Они разделили все сальмонеллы по О-антигенам на группы: А, В, С, D, Е и т. д. Каждая группа характеризуется наличием определенного Оантигена (например, в группе В это «4»). Некоторые группы имеют общие О-антигены (например, группа А, В и D — «1, 12»). Сальмонелла тифа содержит Vi-антиген, который располагается более поверхностно, чем О-антиген, и может препятствовать агглютинации с О-сывороткой. Утрата его ведет к восстановлению О-агглютинации. Vi-антиген легко разрушается при кипячении культуры в течение 10 мин, при добавлении в среду фенола, выращивании микроба на искусственных средах.

У Н-антигенов сальмонелл различают I и II фазы. Первая фаза Н-антигенов различна у серотипов, входящих в одну группу (например, в группе S. paratyphi В— «в», a Salm. typhimurium — «і»). Такое разделение помогает дифференцировать отдельные типы сальмонелл в реакции агглютинации на стекле с монорецепторными сальмонеллезными сыворотками. В реакции агглютинации при взаимодействии Н-антигенов с соответствующими антителами проявляется крупнохлопчатая Н-агглютинация; О- и Vi-агглютинация мелкозернистая.

Помимо серологического типирования сальмонелл, иногда проводят определение фаготипов с помощью специфических сальмонеллезных бактериофагов, которых к настоящему времени известно более 100. Установлено, что одни фаги лизируют сальмонеллы, содержащие О-антиген, другие (Vi-фаги) — только штаммы, содержащие Vi-антиген. Фаготипы сальмонелл стабильны. Метод фаготипирования сальмонелл используется в целях эпидемиологического анализа для выявления источника инфекции.

Патогенность. Среди сальмонелл встречаются типы, патогенные только для человека: сальмонеллы брюшного тифа, паратифов А и В. Есть типы, вызывающие заболевания только у животных. Большинство же патогенно и для человека, и для животных. Разнообразие клинических форм заболеваний, вызываемых сальмонеллами, зависит от свойств возбудителя, массивности заражения, состояния защитных сил макроорганизма и других причин.

Идентификация сальмонелл

После 18-20 часового инкубирования чашек с дифференциально-диагностическими средами (висмут-сульфит агар 48 час.) производится учет характера роста с отбором 3-5 подозрительных колоний на одну из сред для первичной идентификации (Клиглера, Ресселя, Олькеницкого) и на скошенный питательный агар. В случае чрезвычайной эпидемической ситуации культуру, выросшую на указанных средах, используют для последующей постановки реакции агглютинации. Результаты этой реакции ориентировочны и требуют подтверждения на этапе завершения биохимической идентификации.

Культуральные свойства

Общность морфологии и ряда культуральных свойств бактерий рода Salmonella не позволяет типизировать их по указанным признакам. Для этого кроме морфологии и культуральных свойств изучают ферментативные свойства и антигенную структуру, в отдельных случаях ставят биологическую пробу на лабораторных животных.

Ферментативные свойства бактерий обусловлены набором ферментов, отражают определенные условия питания и обмена веществ, свойственные данному виду микроорганизмов в тех или иных условиях внешней среды. Бактерии рода Salmonella характеризуются следующими ферментативными свойствами: не разжижают желатина, не разлагают адонита и не ферментируют сахарозу; подавляющее большинство не расщепляет салицина и не разлагает лактозу, не образует индола, не расщепляет мочевину, не дает реакции Фогес-Проскауера (реакция на ацетилметилкарбинол); ферментирует (за небольшим исключением мальтозу, маннит, сорбит, расщепляет глюкозу с образованием газа (S. typhi, S. pullorum обычно не образуют газа); дает положительную реакцию с метиловым красным, утилизирует аммоний и редуцирует нитраты; большинство из них продуцирует сероводород.

Для изучения ферментативных свойств бактерий рода Salmonella обычно используют короткий цветной (пестрый) ряд, состоящий из сред с глюкозой, маннитом, арабинозой, дульцитом, рамнозой (среда Биттера); глицеринофуксиновый бульон (бульон Штерна). Помимо указанных сред для дифференциации серологических типов сальмонелл используют также среды с мальтозой, инозитом, трегалозой, ксилозой; лакмусовое молоко (изменение лакмусового молока при росте сальмонелл позволяет их дифференцировать по способности образовывать кислоту или щелочь). Вместо лакмусового можно использовать обезжиренное молоко с индикатором бромтимоловым синим (1 мл 0,4%-ного раствора в 100 мл молока). Известное значение для дифференциации сальмонелл имеет образование сероводорода культурой. Протеоли-тические свойства исследуют путем посева изучаемой культуры сальмонелл на МПЖ и молоко.

Ввиду сходства бактерий рода Salmonella с другими микроорганизмами семейства Enterobacteriaceae возникает необходимость их дифференциации. В настоящее время в бактериологической практике широко используют плотные дифференциально-диагностические питательные среды с лактозой (среды Плоскирева, Эндо, Левина). По способности бактерий ферментировать лактозу сальмонеллы отличают от часто сопутствующей Е. сoli, поэтому при исследовании материала на сальмонеллы вначале производят высев на одну из дифференциально-диагностических сред. На этих средах Е. coli, ферментирующая лактозу с образованием кислоты и изменением цвета индикатора, образует колонии, отличающиеся по цвету от колоний сальмонелл, не ферментирующих лактозу. На среде Эндо бактерии Е. coli дают колонии красного цвета, часто с металлическим блеском, сальмонеллы -- бесцветные или бледно-розовые (окрашенные в цвет среды); на среде Плоскирева Е. coli -- колонии оранжево-красного цвета, сальмонеллы -- прозрачные или нежно-розовые; на среде Левина Е.- coli формируют колонии черного цвета, окруженные ободком, сальмонеллы-- прозрачные, нежно-розовые или розовато-фиолетовые. Для дифференциации сальмонелл и культурально сходных штаммов, а также бактерий рода Proteus и бактерий группы кишечных палочек применяют среды с мочевиной (среда Прейса, Ресселя, Олькеницкого), SS-агар (Salmonella -- Shigella -- агар) и др. Цвет этих сред обусловлен неодинаковой интенсивностью расщепления микроорганизмами азотистых веществ с образованием щелочных продуктов. Бактерии группы кишечных палочек и Proteus (за исключением 0-формы), как правило, на SS-aгape не дают роста, а сальмонеллы растут в виде нежных, бесцветных колоний.

Плотные дифференциально-диагностические среды служат лишь для определения принадлежности бактерий к роду Salmonella и отделения их от сопутствующей микрофлоры.

Ферментативные свойства сальмонелл не всегда стабильны и могут изменяться в зависимости от условий внешней среды, поэтому правильное типизирование сальмонелл возможно лишь в результате изучения комплекса морфологических, культуральных, ферментативных свойств и антигенной структуры