Методы количественного определения активности ферментов
Работа 1. Количественное определение активности каталазы крови
(по Баху и Зубковой)
Цель – определить активность каталазы крови (по Баху и Зубковой)
Фермент каталаза (оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.6) содержится в большом количестве в эритроцитах и разлагает перекись водорода с образованием кислорода и воды по уравнению:
2Н2О2 → каталаза О2 + 2Н2О
При количественном определении активности каталазы крови измеряют или количество перекиси водорода, разложенной каталазой, или количество кислорода, выделившегося при этой реакции. Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа и показателя каталазы.
Каталазным числом называют количество миллиграммов Н2О2, которое разлагается 1 мкл крови согласно следующей реакции:
2КМnO4 + 5H2O2 + 4H2SO4→2KHSO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 5O2
О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества КМпО4, израсходованного на титрование до и после действия каталазы.
Показателем каталазы называют дробь, в которой числителем является каталазное число, а знаменателем - число миллионов эритроцитов в 1 мкл исследуемой крови.
При количественном определении активности каталазы нужно сравнивать показатели каталазы, а не каталазные числа, так как фермент содержится почти исключительно в эритроцитах и притом не в гемоглобине, а в строме. Содержание каталазы в крови снижается при ряде заболеваний, таких, как рак, анемия , туберкулез и др.
Ход работы . 1. Приготовление раствора крови . В мерную колбу на 100 мл наливают около 10 мл дистиллированной воды. 0,1 мл крови вносят в колбу с водой. Пипетку промывают несколько раз, набирая жидкость и выпуская её в мерную колбу. Доливают мерную колбу до метки водой, следовательно, кровь развели в 1000 раз и получили основной раствор крови, в 1 мл которого содержится 1 мкл крови. В этом растворе определяют каталазное число.
2. Приготовление опытных и контрольных проб . В две конические колбы на 25 мл (опытную и контрольную) наливают по 7 мл дистиллированной воды и добавляют по 1 мл основного раствора крови. Контрольную колбочку кипятят в течение 2 мин для разрушения каталазы, а опытную оставляют без изменения. После этого обе колбочки оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем в каждую колбочку вносят точно 2 мл 1% раствора Н2О2 и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.
3. Титрование и расчет . В каждую колбочку приливают по 5 мл 10% раствора Н2SO4 и оттитровывают содержимое колбочки 0,1 н. раствором КМпО4 до розового окрашивания.
Рассчитывают активность каталазы, исходя из того, что на титрование контрольной колбочки, где каталаза разрушена, пойдет больше раствора КМпО4, чем на титрование опытной колбочки. Полученную разность умножают на 1,7 и получают каталазное число для исследуемой крови.
Пример расчета . Грамм-эквивалент Н2О2 равен 17 г. Следовательно, в 1 мл 0,1 н. раствора содержится 11,7 мг Н2О2. 1 мл 0,1 н. КМпО4 эквивалентен 1 мл 0,1 н. Н2О2; умножая 1,7 на разность между количеством миллилитров 0,1 н. КМпО4, пошедшего на титрование в контрольной и в опытной колбочках, получают количество миллиграммов Н2О2, которое разлагается 1 мкл исследуемой крови, т. е. получают сразу каталазное число. В норме каталазное число колеблется от 10 до 15 единиц.
Исходя из того, что в 1 мкл крови содержится около 5 млн. эритроцитов, можно рассчитать показатель каталазы:
Вывод
Работа 2. Определение активности каталазы сырого молока
Цель – определить активность каталазы сырого молока; на основании полученных данных отнести исследуемый объект к нормальному или анормальному молоку.
В основу метода положено определение количества разложенного ферментом пероксида водорода. Каталаза - двухкомпонентный фермент, димер, гемопротеид (в активном центре имеет протогематин). Молекулярная масса фермента 225000...230000, оптимум действия находится при рН 7,0...8,0 и температуре 20...40°С (рJ – при рН 5,4...5,7). Действие каталазы проявляется уже при 0°С, нагревание до 75...80°С разрушает её.
Возможный механизм действия каталазы описывается уравнениями:
Каталаза-FеОН + Н2О2 → Каталаза-FеООН + Н2О
Каталаза-FеООН + Н2О2 → Каталаза-FеОН + О2 + Н2О
Активность каталазы выражают в стандартных (Е) и международных (нкат) единицах, а также через объём кислорода, выделившегося из определенного объема молока при определенных условиях.
Зависимость между отдельными единицами активности каталазы: 1 Е = 16,67 нкат = 6,25 см3 кислорода.
Нативная каталаза переходит в молоко из клеток молочной железы, содержится в альбуминовой фракции. Бактериальная каталаза накапливается в молоке при развитии микроорганизмов. Молочнокислая микрофлора каталазу не вырабатывает. Этой способностью обладают психротрофные и гнилостные бактерии. Поэтому определение активности каталазы можно использовать для контроля количества последних в молоке (она может составлять выше16,0 Е).
Повышенная активность каталазы в анормальном молоке позволяет также выявлять его примесь в сборном молоке.
Активность каталазы в свежевыдоенном молоке, полученном от здоровых животных, составляет 4,0 - 16,0 Е, в молозиве 50 - 94, в стародойном молоке – 37 - 50, в маститном - 62 Е и более.
Для определения активности каталазы используют полярографический, манометрический и перманганатометрический методы. Последний метод наиболее точен.
Сущность метода состоит в количественном определении пероксида водорода, разложенного каталазой, содержащейся в 1 см3 молока, за 1 мин при 25°С.
Неразложившийся пероксид водорода оттитровывают раствором перманганата калия в кислой среде (см. реакцию выше).
Количество разложившегося пероксида водорода находят по разнице между контрольным и опытным титрованием.
Ход работы . Перед началом работы часть исследуемого молока кипятят для разрушения каталазы.
В две конические колбы вместимостью 200 см3 пипетками вносят в первую - 2 см3 сырого молока (опытная проба), во вторую - 2 см3 кипяченого молока (контрольная проба). Температура молока (20 ± 1)°С. В обе колбы цилиндром добавляют по 98 см3 дистиллированной воды с температурой (20 ± 1)°С, содержимое колб перемешивают, колбы нагревают на водяной бане до температуры (25 ± 1)°С. Затем в обе колбы пипеткой добавляют по 25 см3 0,3%-ного раствора пероксида водорода, колбы закрывают пробками, их содержимое тщательно перемешивают; колбы помещают в термостат при температуре (25 ± 1)°С. Записывают время начала опыта.
Через 30 мин в обе колбы из бюретки вносят по 5 см3 10%-ного раствора серной кислоты и титруют из бюретки раствором перманганата калия (Сэ = 0,1 моль/дм3) до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. Исчезновение окрашивания в более поздний срок связано с окислением органических составных частей молока.
Обработка результатов . Активность каталазы в стандартных единицах рассчитывают по формуле:
где Vk - объем раствора перманганата калия, израсходованного на титрование контрольной пробы, см3;
Vo - объем раствора перманганата калия, израсходованного на титрование опытной пробы, см3;
1,7 - масса пероксида водорода, соответствующего 1 см3 раствора перманганата калия с эквивалентной концентрацией 0,1 моль/дм3, мг;
m - объем молока, см3 (m = 2 см3);
t - продолжительность выдержки молока с раствором пероксида водорода, мин (t = 30 мин);
0,034 - масса 1 мкМ пероксида водорода, мг.
После подстановки известных значений формула принимает вид:
АЕ = (Vk - Vo ) · 0,83 (Е)
Примечание. 1 . Предлагаемая методика измерения активности каталазы рекомендуется для исследования сырого молока с активностью каталазы не выше 20 Е. 2. При исследовании анормального молока следует брать для анализа не все разведение молока (100 см3), а 20 см3. В этом случае расчетная формула будет иметь вид:
АЕ = (Vk - Vo ) · 4,15 (Е)
Вывод
Работа 3. Определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц
Цель – определить сукцинатдегидрогеназу мышц.
Сукцинатдегидрогеназа (КФ 1.3.99.1) очень распространена в тканях животных, растений и микроорганизмов, катализирует дегидрирование янтарной кислоты, при котором последняя превращается в фумаровую кислоту:
При добавлении в среду окисленной формы метиленовой синей, восстановленная сукцинатдегидрогеназа передает водород на метиленовую синюю, образуя бесцветное лейкосоединение:
Материалы исследования и реактивы: | Оборудование: |
1. Гомогенат мышц (в 1 мл 100 мг ткани) | 1. Пробирки химические |
2. Автоматические пипетки |
|
а) 9,078 г однозамещенного кислого фосфорнокислого калия растворяют в 1 л прокипяченной и охлажденной дистиллированной воды | 3. Стеклянные палочки |
4. Термостат |
|
5. Ледяная баня |
|
б) 11,867 г двузамещенного кислого фосфонокислого натрия (Na2HPO4·12H2O) растворяют в 1 л прокипяченной дистиллированной воды в) смешать полученные растворы в соотношении 1:1 | |
3. Янтарная кислота, 0,01 н. нейтрализованный раствор |
|
4. Метиленовая синяя, 0,05% раствор |
|
5. Агар-агар |
|
Ход работы . В две пробирки (опытную и контрольную) помещают 2 мл гомогената мышц. Содержимое контрольной пробы кипятят и охлаждают.
В обе пробирки наливают по 1 мл фосфатного буфера рН 6,8, по 2 мл 0,01 н. нейтрализованного раствора янтарной кислоты и по 2 капли 0,05% раствора метиленовой синей.
Заливают содержимое обеих пробирок 2 мл подогретого агар-агара и кладут их на лёд для застывания. Пробирки помещают в термостат при 37°С. Опыт считают законченным, когда в опытной пробирке жидкость будет почти бесцветной. В контрольной пробирке жидкость не изменяет окраску, поскольку фермент денатурируется при нагревании.
Критерием активности сукцинатдегидрогеназы является время обесцвечивания метиленовой синей в присутствии янтарной кислоты в анаэробных условиях.
Работа 4. Определение эффективности пастеризации молока пробой на
лактопероксидазу
Цель – определить активность лактопероксидазы, на основании полученных результатов отнести исследуемый объект к пастеризованному, либо непастеризованному молоку.
Способность пероксидазы выдерживать нагревание до 80°С положена в основу метода контроля высокотемпературной пастеризации молока (ГОСТ 3623-73. «Молоко и молочные продукты. Методы определения пастеризации»).
Фермент пероксидаза относится к классу оксидоредуктаз, катализирует окисление различных соединений в присутствии пероксида водорода вследствие выделения активного атомарного кислорода.
Пероксидаза - двухкомпонентный фермент, димер, гликогемопротеид, его молекулярная масса составляет 76000 - 93000, имеет оптимум действия при рН = 6,0 - 7,0 и температуре 20 - 25°С (рJ фермента = 9,6). Фермент термоустойчив, инактивируется при температуре выше 80°С. Возможна его реактивация после нагревания. Механизм действия фермента описывается уравнением:
Н2О2 → О + Н2О
Нативная пероксидаза (лактопероксидаза) синтезируется клетками молочной железы; часть её поступает в молоко с лейкоцитами (миелопероксидаза). Фермент связан с альбуминовой фракцией молока.
В молоке содержится 3 - 10 мг% пероксидазы, в молозиве её содержание выше. Активность пероксидазы в свежевыдоенном молоке также довольно высока и составляет 370 нкат.
Лактопероксидаза вместе с тиоцианатом и пероксидом водорода входит в антибактериальную систему молока. Так, лактопероксидаза катализирует окисление тиоцианата, а образующиеся продукты (гипотиоцианат и др.) подавляют жизнедеятельность микроорганизмов, особенно грамотрицательных, в том числе патогенных.
Как указывалось выше, пероксидаза расщепляет пероксид водорода с образованием активного атомарного кислорода. Активный кислород окисляет йодид калия, при этом восстанавливается йод.
При наличии крахмала в реакционной смеси она принимает сине-фиолетовое окрашивание.
Ход работы. В пробирку вместимостью 10 см3 пипеткой вносят 5 см3 исследуемого молока, 5 капель раствора йодкалиевого крахмала и 5 капель 0,5%-ного раствора пероксида водорода. Содержимое пробирки перемешивают после добавления каждого реактива. Через 2 мин анализируют окрашивание содержимого пробирки.
Оценка результатов . Если окрашивание молока в пробирке не изменилось, то фермент, пероксидаза в нем отсутствовал, следовательно, молоко подвергалось пастеризации при температуре не ниже 80°С.
Появление в пробирке сине-фиолетового окрашивания свидетельствует о наличии пероксидазы. Следовательно, молоко не подвергалось пастеризации или температура пастеризации была ниже 80°С, или пастеризованное молоко было смешано с непастеризованным.
Появление окрашивания в пробирках более чем через 2 мин после добавления реактивов, не указывает на отсутствие пастеризации, так как может быть вызвано разложением реактивов.
Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление не менее 5% непастеризованного молока к пастеризованному.
Вывод
Вопросы
1. Какие вещества называются ферментами?
2. Каковы их химическая природа и свойства?
3. Что такое специфичность действия ферментов и как она определяется?
4. Как зависит активность ферментов от температуры?
5. Как влияет величина рН среды на ферментативную активность?
6. Какие вещества называются активаторами и ингибиторами ферментов? Приведите примеры
7. Какие качественные и количественные методы используются для изучения действия ферментов?
8. Что представляет собой единица активности ферментов?
9. На чем основан метод определения активности амилазы и каково диагностическое значение этого определения?
10. Как определяют активность каталазы крови?
11. Каковы основные принципы метода определения активности сукцинатдегидрогеназы в мышцах?
Введение
Настоящее пособие предназначено для ознакомления студентов как с классическими методами исследования ферментов, так и с современными, высокочувствительными аналитическими методами, использующими ферменты как инструменты исследований. Пособие состоит из пяти разделов:
1. Методы определения активности ферментов.
2. Изучение кинетических параметров ферментативных реакций.
3. Методы выделения и очистки ферментов.
4. Изучение субклеточной локализации ферментов.
5. Использование ферментов в качестве аналитических реагентов.
Все разделы «Практикума» имеют самостоятельные задачи, однако требования, предъявляемые к студентам, остаются одинаковыми. Каждая предлагаемая работа представляет собой небольшое экспериментальное исследование. При выполнении любой из них студент должен самостоятельно подготовить все нужные растворы, освоить необходимые методы исследования, провести эксперимент и оформить результаты в виде отчета, иллюстрируя полученные данные таблицами и графиками.
Уровень используемых методических приемов соответствует требованиям современной науки. При необходимости в описании работы приводятся краткие теоретические сведения. Все работы, включенные в «Практикум», неоднократно выполнялись студентами.
Работа 1. Титрометрическое определение активности каталазы
Оборудование и реактивы: кипящая водяная баня; пипетки на 5, 10, 20 и 25 мл; цилиндры измерительные с носиком на 10 и 25 мл; колба мерная на 100 мл; колбы конические на 200 мл; ступка с пестиком фарфоровые; перманганат калия (0,1 н); серная кислота (10 %); карбонат натрия; пероксид водорода (0,1 н); свежий растительный материал (картофель или морковь).
2 г сырого картофеля (или моркови) растирают в ступке, постепенно добавляя 2-3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат натрия до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до объема 100 мл. Смесь оставляют стоять в течение 30 минут, после чего ее фильтруют. Далее определяют активность по схеме (2 опытных пробы и 2 контрольных):
Опыт и контроль титруют 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин бледно-розового окрашивания). Отмечают количество раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося (после ферментативного разложения) пероксида водорода в опытной колбе и на титрование всего пероксида водорода в контрольной. По разности между опытным и контрольным титрованием находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментом пероксида водорода.
Расчет ведут в соответствии с уравнением реакции:
5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 > 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O,
согласно которому 1 мл 0,1 н раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода.
Пример расчета: из 1,25 г моркови приготовлена вытяжка каталазы объемом 100 мл: на титрование опытной пробы затрачено 15,5 мл, контрольной 30,2 мл 0,1 н раствора перманганата калия. Количество разложенного пероксида водорода в пробе эквивалентно (30,2 - 15,5) 14,7 мл 0,1 н. раствора перманганата калия и, следовательно, равно (14,7 1,7) 24,99 мг. Значит, в 1 г сырой моркови содержится количество каталазы, способное разложить = 99, 96 мг пероксида водорода, а за 1 мин - (99,96:30) 3,33 мг. Так как 1 мкмоль пероксида водорода составляет 0,034 мг, то в 1 г моркови присутствует (3,33:0,034) 100 Е каталазы.
1. Рассчитайте содержание каталазы в исследуемом материале.
2. Напишите систематическое название данного фермента, его код по систематическому каталогу и опишите его биологическую роль.
Определение активности каталазы
(по А.Н. Баху и А.И. Опарину)
Оксидоредуктазы – класс ферментов катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Окисление мономеров, образующихся в процессе катаболизма полимеров, представляет собой сложный многоступенчатый процесс.
Окисление веществ в клетках протекает, в основном, путем отщепления водорода (дегидрированием) или отщеплением электронов или путем присоединения кислорода к молекуле окисляемого соединения.
Акцепторами водорода у дегидрогеназ является НАД + , НАДФ, ФАД и ФМН, у некоторых флавиновых – кислород (их называют оксидазами), у гемсодержащих (пероксидаз и каталазы) – Н 2 О 2 (пероксид водорода).
Акцепторами и переносчиками электронов являются цитохромы, содержащие гем (гемопротеины).
Каталаза (КФ 1.11.1.6) относится к гемопротеинам, катализирует процесс разрушения ядовитого для клеток пероксида водорода на воду и кислород: 2 H 2 O 2 = 2 H 2 O + O 2 .
Для живой клетки пероксид водорода является сильным ядом, поэтому все ферменты образующие и обезвреживающие Н 2 О 2 находятся в пероксисомах – органеллах покрытых мембраной. Главными потребителями Н 2 О 2 являются пероксидазы (КФ 1.11.1.7.), которые окисляют фенолы, амины, некоторые гетероциклические соединения и др. субстраты дегидрированием, переносят снятые с субстратов на Н 2 О 2 , восстанавливая его до 2 Н 2 О. Молекулы пероксида водорода, невостребованные пероксидазами, обезвреживаются каталазой.
Метод определения активности каталазы основан на определении количества пероксида водорода, расщепленного в процессе инкубации с ферментом. Количество H 2 O 2 в реакционной смеси определяют титрованием в кислой среде раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л:
5 H 2 O 2 + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 = 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 +8H 2 O
На основании приведенного уравнения реакции можно рассчитать, что 1 мл раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л соответствует 1,7 мг (50 мкмоль) пероксида водорода.
ХОД РАБОТЫ. 2-3 г сырого картофеля (или другого свежего растительного материала) тщательно растирают в ступке с кварцевым песком или стеклом. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике скальпеля CaCO 3 до прекращения выделения пузырьков СО 2 . В процессе растирания в ступку добавляют небольшими порциями 40-50 мл воды. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят водой до метки и перемешивают. Смесь оставляют стоять 10-15 мин и после перемешивания фильтруют.
Берут две конические колбочки вместимостью 150-200 мл и вносят в них по 20 мл полученного фильтрата. Содержимое одной колбы кипятят в течение 1 мин и охлаждают до комнатной температуры (контроль). Другая колба опытная содержит активный фермент. К содержимому опытной и контрольной колб приливают по 20 мл воды и по 3 мл раствора с массовой долей H 2 O 2 1 %. Содержимое тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. По окончании инкубации в обе колбы добавляют по 5 мл раствора с массовой долей серной кислоты 10 %, перемешивают и избыток H 2 O 2 в каждой колбе оттитровывают раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л до образования розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин.
Активность каталазы выражают в мкмоль пероксида водорода, расщепившегося под действием фермента в расчете на 1 г исследуемого материала (или на 1 мг вытяжки из него) за 1 мин. Вычисление ведут по формуле:
где Х – активность каталазы, Е/г;
(а-b) – разность между объемами раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л, пошедшего на титрование контрольной (а) и опытной (b) проб, мл;
Т – титр примененного для титрования раствора перманганата калия;
50 – коэффициент пересчета на мкмоль H 2 O 2 ;
100 – общий объем приготовленного экстракта;
m – масса взятого для анализа материала, г;
20 – объем фильтрата, взятого для анализа, мл;
30 – время инкубации, мин.
Принцип определения, порядок анализа и результат анализа записывают.
Активность каталазы можно определить и по объему кислорода, выделившегося после прибавления к исследуемому объекту H 2 O 2 .
Этот принцип используют для определения активности каталазы в молоке, выражаемую каталазным числом, представляющим собой объем кислорода (мл) выделившийся за 2 часа при 25 °С из добавленных к 15 мл молока 5 мг раствора с массовой долей H 2 O 2 1 %. Молоко, полученное от здоровых животных, выделяет 0,7-2,5 мл кислорода, т.е. каталазное число натурального молока составляет не более 2,5. Молоко, полученное от больных животных (мастит и др.), и молозиво имеют повышенные каталазные числа, достигающие до 15.
РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; кальций углекислый (порошок); раствор с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л; растворы с массовыми долями: пероксида водорода 1 % (10 мл раствора с массовой долей H 2 O 2 30 % разбавить водой до 300 мл), серной кислоты 10 %.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.
1. Основные пути окисления субстратов в клетке.
2. Характеристика строения и действия НАД + - и НАДФ-зависимых дегидрогеназ.
3. Характеристика строения и действия ФАД-зависимых дегидрогеназ.
4. Какие ферменты называют оксидазами? Их кофакторы.
5. Характеристика строения и действия пероксидаз и каталаз.
6. Характеристика строения и действия цитохромов.
7. Химизм, образование и пути обезвреживания пероксида водорода в клетках.
8. Метод определения активности каталазы.
Лабораторная работа № 1Тема: Каталитическая активность ферментов в живых клетках
Цель: выявить каталитическую функцию белков в живых клетках, сформировать знания о роли ферментов в клетках, закрепить умение работать с микроскопом, проводить опыты и объяснять результаты работы. Оборудование: сырой и варёный картофель, лист элодеи (другого растения), свежий 3% -ный раствор пероксида водорода, пробирки, пинцет, песок, ступка и пестик, тетрадь, ручка, простой карандаш, линейка.
Ход работы:
Приготовьте двепробирок, и поместите в первую немного песка, во вторую - кусочек сырого картофеля, в третью – кусочек варёного картофеля Капните в каждую из пробирок немного пероксида водорода. Пронаблюдайте, что будет происходить в каждой из пробирок.
Измельчите в ступке кусочек сырого картофеля с небольшим количеством песка.
Перенесите измельчённый картофель вместе с песком в пробирку и капните немного пероксида водорода.
Сравните активность измельчённой и целой растительной ткани.
Составьте таблицу, показывающую активность каждой ткани при различной обработке. Объясните полученные результаты. Ответьте на вопросы:
Наблюдения
Перекись водорода и сырой картофель
Выделяется кислород, белок распадается до первичной структуры и превращается в пену
Перекись водорода и вареный картофель
Реакции нет
Ответьте на вопросы: В каких пробирках проявилась активность фермента каталазы? Объясните, почему.
Каталаза фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода на воду и молекулярный кислород: Н2О2 + Н2О2 = О2 + 2Н2О. Биологическая роль К. заключается в деградации перекиси водорода, образующейся в клетках в результате действия ряда флавопротеиновых оксидаз (ксантиноксидазы, глюкозооксидазы, моноаминоксидазы и др.), и обеспечении эффективной защиты клеточных структур от разрушения под действием перекиси водорода. Генетически обусловленная недостаточность К. является одной из причин так называемой акаталазии - наследственного заболевания, клинически проявляющегося изъязвлением слизистой оболочки носа и ротовой полости, иногда резко выраженными атрофическими изменениями альвеолярных перегородок и выпадением зубов. Активность проявилась в 1,3 пробирках, т.к. в них были сырые продукты, содержащие белки. А в остальных пробирках были продукты с разрушенным в процессе варки белком и реакция не проявилась. Поэтому организмом лучше усваиваются продукты, содержащие белок.
Как проявляется активность фермента в живых и мёртвых тканях? Объясните наблюдаемое явление. В мертвых тканях активность ферментов отсутствует, т.к. белок в них был разрушен при варке. А в живых тканях при взаимодействии с перекисью водорода выделялся кислород, а белок расщепляясь до первичной структуры превращался в пену.
Как влияет измельчение ткани на активность фермента в живых тканях растений и животных? При измельчении живой ткани реакция проходит быстрее, т.к. площадь соприкосновения белка и перекиси водорода увеличивается Как бы вы предложили измерить скорость разложения пероксида водорода? v=kc(a)c(b) где v является скоростью химической реакции k – константа скорости с – изменение концентрации Как вы считаете, все ли живые организмы содержат фермент каталазу, обеспечивающий разложение пероксида водорода?
Ответ обоснуйте. Так как это фермент класса оксидоредуктаз, то он катализирует разложение токсичного для живых клеток пероксида водорода на воду и кислород. Содержится в лизосомах. Можно сделать вывод, что содержится во всех клетках живых организмов. Объясните свои наблюдения. Сформулируйте вывод.
Вывод: белок содержится только в живых продуктах, а в варенных продуктах белок разрушен, поэтому никакой реакции с ними не происходит. Если же измельчить продукты, то реакция будет проходить быстрее.
Лабораторная работа № 1
РОЛЬ ФЕРМЕНТОВ В УСКОРЕНИИ РЕАКЦИИ В КЛЕТКЕ
(ВЫЯВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ)
Цель: обнаружить действие фермента каталазы в растительных и животных клетках, сравнить ферментативную активность натуральных и повреждённых кипячением клеток.
Оборудование : 3%-ный раствор перекиси водорода, кусочки сырых и отварных картофеля и мяса (печени, лёгких), пробирки.
Выявление активности каталазы
Каталаза – это фермент, катализирующий разложение пероксида водорода с образованием молекулярного кислорода, выделяющегося в виде пузырьков газа:
каталаза
2 H 2 O 2 _ → 2H 2 O + O 2
Пероксид водорода образуется в некоторых растительных и животных клетках в качестве побочного продукта окислительно-восстановительных реакций. Соединение это токсично для клеток, и каталаза обеспечивает эффективное его удаление. Каталаза – один из наиболее быстро работающих ферментов: одна молекула каталазы разлагает в одну секунду до 200 000 молекул пероксида водорода. Локализуется каталаза в мембранных пузырьках клеток – микротельцах и пероксисомах.
Ход работы
Возьмите 4 чистые пробирки и поместите в первую из них небольшое количество мелко натёртого картофеля, во вторую – немного отварного картофеля, в третью – мелко измельчённые кусочки мяса (печени, лёгкого), в четвёртую – немного измельчённого отварного мяса. В каждую пробирку добавьте по 3-4 мл. 3%-ного раствора перекиси водорода. Пронаблюдайте, что происходит в пробирках. Результаты наблюдения занесите в таблицу.
Ферментативная активность натуральных и повреждённых клеток
| Объект | Явления, наблюдаемые в пробирке | Объяснение наблюдений |
| Сырой картофель | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ |
| Отварной картофель | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ |
| Сырое мясо | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ |
| Отварное мясо | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ |
Объясните полученные результаты. Сделайте вывод о каталитической активности каталазы в живых и мёртвых клетках.
Вывод: ________
_______________
_______________
_____________
1. Что такое ферменты? Какой структурой белков создаётся их активность?___________
2. Какими свойствами обладают ферменты?______
3. Что называется активным центром фермента? Сколько таких центров может быть в ферменте?_
4. За счёт чего ферменты ускоряют химические реакции?___________________________
5. *Спирт, фенол, хлорамин и другие антисептики используются в медицине для обработки участков тела, загрязнённых патогенной флорой. Объясните, почему._____
Гр.___3
Лабораторная работа № 2
ВЫЯВЛЕНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
Цель: выявить органические вещества в тканях (крахмал, белок, жиры) и изучить их свойства.
Оборудование: марлевый мешочек, размолотые зёрна пшеницы (пшеничная мука), 5%-ный раствор йода, семена подсолнечника (или любой другой масличной культуры: хлопчатника, лна, арахиса, сои и т. д.).
Органические соединения – углеродсодержащие вещества, характерные для живой природы, составляют в среднем 20-30% массы клеток живых организмов. Главные свойства клеток и организмов определяют органические полимеры: белки, углеводы, нуклеиновые кислоты, а также сложные соединения – жиры и ряд молекул гормонов, пигментов, отдельных нуклеотидов, в частности АТФ. Помимо органических веществ в клетках содержатся минеральные вещества и вода, однако содержание органических веществ всегда выше. Количество органических веществ может быть различным.
Белки – нерегулярные, или информационные, полимеры, мономерами которых являются аминокислоты.
По своему составу белки подразделяются на:
- простые – состоят из одних аминокислот. Например, растительные белки – проламины, они содержатся в клейковине семян злаков, не растворяются в воде;
- сложные – помимо аминокислот имеют в своём составе другие органические соединения (нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы), соединения фосфора, металлы. Соответственно они носят названия: нуклеопротеидов, липопротеидов, гликопротеидов, фосфо- и металлопротеидов.
Углеводы – соединения, содержащие углерод, водород и кислород. Подразделяются на моно-, ди- и полисахариды. Полисахариды – высокомолекулярные углеводы, состоящие из большого числа моносахаридов, их молекулярная масса велика, молекулы имеют линейную или разветвлённую структуру. В функциональном отношении различают полисахариды резервного и структурного назначения. Не растворимый в воде крахмал – главный резервный полисахарид растительных клеток (полимер ά – глюкозы); при действии на него йода синеет; содержится в большом количестве в клубнях картофеля, плодах, семенах. Гликоген – полисахарид, содержащийся в тканях тела человека и животных, а также в грибах и дрожжах, - играет важную роль в превращениях углеводов в клетках. Клетчатка (целлюлоза) – основной структурный полисахарид клеточных оболочек растений.
Липиды и липоиды – жиры и жироподобные вещества – органические соединения с различной структурой. Они не растворяются в воде, но хорошо растворяются в органических соединениях: эфире, бензине, хлороформе и др..
По химической структуре липиды – соединения глицерина – трёхатомного спирта – с высокомолекулярными органическими кислотами (жирными), не имеют полимерной структуры.
Состав семян